Морфологические изменения кожи у экспериментальных животных под воздействием мочевины

Научный отдел (руководитель — доктор мед. наук В. И. Альбанова) Фармацевтического научно-производственного предприятия "Ретиноиды", Москва; кафедра гистологии, цитологии и эмбриологии (зав. — проф. В. И. Ноздрин) ГОУ ВПО Орловский государственный университет, медицинский институт.

Изучали гистоструктуру кожи подошвы задних лап морских свинок через 2 недели ежедневного нанесения мази, содержащей 30% мочевины (30% ММ). Обнаружили морфологические проявления кератолитического эффекта в виде разрыхления и отслойки рогового слоя эпидермиса. С использованием компьютерных технологий выявили достоверное снижение толщины клеточного эпидермиса. Применение моноклональных антител позволило установить в этих условиях снижение в эпидермисе количества PCNA-позитивных ядер. Аппликации 30, 40, 50% ММ на кожу хвоста крыс в течение I и 6 месяцев вызвали сходные с предыдущим экспериментом изменения гистоструктуры эпидермиса и морфометрических показателей его толщины. Через I месяц после отмены 6-месячных аппликаций ММ морфологические проявления кератолитической активности мочевины частично исчезали, в то время как уменьшение толщины росткового слоя эпидермиса сохранялось. Сделан вывод о том, что эффективность воздействия мочевины в составе мазевых композиций на избыточное ороговение обусловливается не только прямым кератолитическим действием, но и уменьшением образования кератина вследствие снижения пролиферации кератиноцитов.

Ключевые слова: мочевина, эпидермис, PCNA

The histostructure of the hind leg sole skin was studied in guinea pigs after 2-week daily application of 30% urea ointment (30% UO). The morphological manifestations of its keratolytic effect as epidermal corneal layer loosening and detachment were detected. Computer technologies were used to reveal a significant decrease in the thickness of the cellular epidermis. The use of monoclonal antibodies established the smaller number of _PCNA-positive nuclei in the epidermis. One- and six-month applications of 30, 40, and 50% UO to the rat tail skin caused the changes in the histostructure of the epidermis and in the morphometric parameters of its thickness, which were similar to those observed in the previous experiment. A month after discontinuation of 6-month UO applications, the morphological manifestations of urea keratolytic activity partially disappeared while the lesser thickness of the epidermal corneal layer preserved. It is concluded that the efficiency of urea applied as a component of ointment compositions on hyperkeratinization is determined by not only its direct keratolytic activity, but also by diminished keratin formation due to the decreased proliferation of keratinocytes.

Key words: urea, epidermis, PCNA

Мочевина (карбамид) применяется в медицине в составе различных лекарственных форм, предназначенных для внутреннего и наружного применения. В дерматологической практике она используется в виде мазей (5—40%). Фармакотерапевтические эффекты от воздействия этих препаратов связаны с увлажняющими и кератолитическими свойствами мочевины, а также с ее способностью усиливать проникновение через кожу других веществ. В хирургии растворы и мази с мочевиной (ММ) применяют для растворения струпов. Работы, посвященные дерматотропной активности препаратов с мочевиной, относятся, главным образом, к области их клинической эффективности, значительно реже встречаются публикации, затрагивающие механизмы и структурные аспекты наблюдаемых эффектов. Одним из распространенных патологических процессов является роговая дистрофия (патологическое ороговение), характеризующаяся избыточным образованием кератина в эпидермисе (гиперкератоз) или образованием рогового вещества там, где в норме оно не встречается (например, на слизистых оболочках полости рта, пищевода, шейки матки). Поиски современных способов коррекции этого состояния весьма актуальны. В данной работе представлены результаты исследований морфологических проявлений фармакологической активности дерматотропного средства для наружного применения, обладающего кератолитическими свойствами.

Цель исследования — изучить морфологические аспекты действия на кожу мочевины в составе мазей для наружного применения в свете понимания механизмов ее дерматотропной активности.

Материалы и методы

Исследование 1. Влияние ММ на гистоструктуру неповрежденной кожи у экспериментальных животных в условиях непродолжительного воздействия.

Экспериментальными животными служили самцы морских свинок-альбиносов массой тела 250—300 г, которых разделили на две группы по 5 особей в каждой: I) интактные животные (контроль); 2) животные, получавшие аппликации изучаемого средства (мази для наружного применения на эмульсионной основе, содержащей 30% мочевины).

На подошвы задних конечностей морских свинок наносили 0,5 г 30% ММ двукратно (утром и вечером) 5 раз в неделю в течение 2 недель. По окончании эксперимента животных умерщвляли парами хлороформа с соблюдением методических рекомендаций по выведению животных из эксперимента |2|. Образцы кожи из области аппликаций фиксировали в 10% нейтральном формалине, дегидратировали и заливали в парафин. Окрашенные гематоксилином и эозином срезы изучали с помощью светового микроскопа "Axioscop-2" ("Zeiss”, Германия). Морфометрические исследования проводили на аппаратно-программном комплексе "Диаморф" (Россия) с использованием программы компьютерного анализа видеоизображений "CITO". Измеряли толщину клеточного (до рогового слоя — PC) эпидермиса в области верхушек сосочков дермы и наиболее глубокой части эпидермальных гребешков; измерения проводили при увеличении объектива в 20 раз во всех полях зрения (ПЗ) среза кожи подошв задних лап каждого животного.

Таблица 1

Исследование 2. Влияние ММ на гистоструктуру неповрежденной кожи у экспериментальных животных в условиях длительного воздействия.

Опыты проводили на белых аутбредных крысах-самцах (исходная масса тела 170—180 г) и самках (исходная масса тела 160—165 г). Экспериментальные животные ежедневно (5 раз в неделю) получали накожные аппликации (по 0,5 г) 30%, 40% и 50% ММ. Контролем служила кожа крыс, у которых мазевые аппликации не использовали. Материал для исследования брали через 1 и 6 мес. от начала эксперимента, а также через I мес после окончания нанесения препаратов. Таким образом, для каждого из вышеназванных сроков исследования животных разделили на 4 группы (по 5 самцов и 5 самок в каждой): 1) интактные животные (контроль); 2) животные, получавшие аппликации 30% ММ; 3) животные, получавшие аппликации 40% ММ; 4) животные, получавшие аппликации 50% ММ.

Условия умерщвления животных, взятия фрагментов кожи из области аппликаций, приготовления препаратов, микроскопического и морфометрического исследований соответствовали описанным в "Исследовании I". Определение толщины росткового слоя эпидермиса (до зернистого слоя) проводили без учета глубины эпидермальных гребешков и высоты сосочков, так как в коже хвоста крыс глубокие сосочки отсутствуют (по 3 измерения в 20 ПЗ подряд от края среза при увеличении объектива в 40 раз).

Исследование 3. Влияние ММ на экспрессию _PCNA (Proliferation Cell Nuclear Antigen) кератиноцитами эпидермиса неповрежденной кожи в условиях непродолжительного воздействия.

Объектом изучения служили парафиновые блоки эксперимента, представленного в разделе "Исследование 1". После депарафинирования срезов проводили высокотемпературную демаскировку антигенов кипячением образцов в 10 ММ нитратном буфере на водяной бане. Для иммуногистохимической реакции применяли антитела к _PCNA (Clone PC 10) фирмы "Labvision" (США). PCNA представляет собой циклин молекулярной массой 36 кД, является неотъемлемой частью ДНК-полимеразы 8, выявляется на всех стадиях митотического цикла и отражает общий уровень синтеза ДНК. Результаты визуализировали с помощью непрямой стрептавидин-биотиновой пероксидазной реакции с использованием Ultra Vision Detection System HRP/DAB той же фирмы, после чего срезы докрашивали гематоксилином Караци. Для оценки качества постановки реакции окрашивания использовали стекла с позитивным контролем той же фирмы. Подсчет РСHА+-ядер проводили с помощью объектива с увеличением в 63 раза у контрольных и подопытных животных в двух ПЗ среза у каждой особи (50 базальных эпидермоцитов и все шиповатые клетки над ними в одном ПЗ). Индекс _PCNA (I_PCNA) рассчитывали по формуле I_PCNA (%)=(N_PCNA+/N)·100, где N_PCNA+ — количество меченых ядер, а N — общее число ядер в базальном и шиповатом слоях в ПЗ.

Результаты исследований статистически обрабатывали с помощью наименьших квадратов разностей и t-критерия Стьюдента. Статистически значимыми считали те, у которых уровень вероятности не менее 95% (в табл. 1—5 отмечены звездочкой).

Результаты

Исследование 1. В коже подошвы задних лап морских свинок эпидермис отличается сильным ороговением. В него вдаются многочисленные высокие, обильно васкуляризированные дермальные сосочки, а в дерму — глубокие эпидермальные гребешки. Эпидермис толстый, базальные кератиноциты имеют цилиндрическую форму, зернистый слой представлен 2—4 рядами клеток. PC широкий, на большем протяжении плотно прилежит к зернистому слою, в основном монолитен, но между пластами роговых чешуек встречаются щелевидные пространства. Сосочковый и сетчатый слои дермы без особенностей. Гиподерма прерывистая, жировые дольки чередуются с соединительнотканными прослойками. Здесь же располагаются секреторные отделы желез, по морфологическим характеристикам тождественных потовым; другие производные кожи отсутствуют. Таким образом, интактная кожа подошвы лап морских свинок имеет строение "толстой" кожи (рис. 1, а). Результатом воздействия в течение 2 недель на кожу 30% ММ являются снижение толщины эпидермиса, а также уменьшение ширины и степени монолитности PC, его расслоение, разрыхление и нередко отхождение от зернистого слоя (рис. 1, б). В нижних рядах клеток шиповатого слоя в некоторых препаратах встречается умеренное количество кератиноцитов с признаками перинуклеарной вакуолизации. Гистоструктура дермы, гиподермы и желез практически не отличается от контрольной. Морфометрические исследования подтвердили визуальные наблюдения (табл. 1).

Из приведенных данных видно, что воздействие 30% ММ в условиях ежедневных в течение 2 недель аппликаций достоверно снижает толщину клеточного эпидермиса кожи подошвы лап по сравнению с контрольными показателями как в области вершины дермальных сосочков, так и на уровне эпидермальных гребешков.

Исследование 2. Кожа хвоста интактных крыс характеризуется широким PC эпидермиса, нередко превышающим высоту клеточного пласта в 2—3 раза. Зернистый слой выражен слабо, прерывистый; базальная мембрана ровная, сосочки практически не контурируются (рис. 2, а). Сальные железы хорошо развиты, образуют комплексы с волосяными фолликулами (ВФ). Стержни волос в месте выхода из устьев ВФ оплетены кератиновыми пластами (рис. 2, б). Половые отличия выражены неярко. Ежедневные в течение месяца аппликации на кожу хвоста 30% ММ приводят к уменьшению толщины эпидермиса и отчетливой дезинтеграции PC, что проявляется в его разволокнении, отслойке от клеточного эпидермиса и расширении устьев ВФ (рис. 2, в, г). Под эпидермисом встречаются редкие, слабовыраженные скопления мононуклеарных клеток. 40% и 50% ММ вызывают в коже изменения, сходные с описанными выше. При этом также наблюдаются очаги локальной гиперплазии эпидермиса, перинуклеарная вакуолизация отдельных кератиноцитов, отек и умеренная инфильтрация дермы, т. е. морфологические признаки, свидетельствующие о напряжении функционирования кожных структур. Морфометрическое исследование продемонстрировало, что у самцов и самок крыс под воздействием ММ в условиях ежедневного в течение I мес нанесения их на кожу хвоста имеет место достоверное уменьшение толщины росткового слоя эпидермиса (табл. 2).

В условиях 6-месячного эксперимента гистоструктура кожи контрольных крыс близка к таковой в контроле предыдущего срока; при этом встречаются вакуолизированные кератиноциты, участки паракератоза. Ежедневное в течение 6 мес. нанесение на кожу хвоста 30% ММ вызывает уменьшение числа рядов клеток в эпидермисе, разволокнение и отслойку его PC, расширение устьев ВФ. Встречаются редкие участки погружения эпидермиса в дерму в сочетании с перифокальным воспалением (инфильтрация соединительной ткани, расширение гемокапилляров). При аппликации 40% и 50% ММ к отмеченным особенностям присоединяются прерывистость эпидермального пласта, локальные нарушения целостности дермо-эпидермального соединения, отек дермы и гиподермы. Количественное определение толщины эпидермиса подтверждает результаты гистологического исследования (табл. 3), так как во всех подопытных группах имеет место уменьшение данного показателя по сравнению с контрольным (больше у самцов), а в контроле — по сравнению с соответствующими значениями у более молодых животных (см. табл. 2).

Строение кожи контрольных животных через 1 мес. после окончания эксперимента с длительным нанесением ММ характеризуется увеличением представительства вакуолизированных кератиноцитов, появлением роговых пробок, локальными нарушениями целостности дермо-эпидермального соединения. Кожа хвоста крыс подопытных групп близка к контрольной; PC эпидермиса относительно сохранный; вакуолизация кератиноцитов проявляется слабее, чем в контроле. Показатели толщины росткового слоя эпидермиса представлены в табл. 4.

Согласно приведенным показателям, через 1 мес. после окончания ежедневного в течение полугода нанесения на кожу 30%, 40% и 50% ММ отмечен эффект уменьшения толщины росткового слоя эпидермиса в зоне аппликаций.

Исследование 3. В эксперименте с применением моноклональных антител PCNA-позитивные ядра (окрашиваются в коричневый цвет) обнаруживаются в базальном слое эпидермиса, нижних рядах клеток шиповатого слоя и не встречаются в зернистом слое. В экспериментальной группе их число представляется визуально сниженным, что подтверждается результатами их подсчета, выявившими достоверное снижение I^PCNA (табл. 5).

Обсуждение

Основной эффект дерматотропной активности мочевины в составе мазевых композиций в условиях непродолжительного и длительного воздействий на кожу может быть охарактеризован как кератолитический, в данном случае в отношении мягкого кератина. Выявленное при этом снижение высоты эпидермиса совпадает с результатами других исследователей [6, 8]. Принимая во внимание данные литературы об уменьшении под влиянием мочевины индекса включения H3-тимидина в ДНК клеток эпидермиса [5] и результаты использования моноклональных антител к маркеру пролиферации [6], отмеченный феномен можно рассматривать как следствие угнетения в исследованных условиях пролиферативной активности кератиноцитов. Собственные данные, демонстрирующие снижение I^PCNA в ростковом слое эпидермиса в результате аппликаций ММ, свидетельствуют о подавлении синтеза ДНК в этих клетках, следствием чего может быть снижение как пролиферативной активности кератиноцитов, так и степени полиплоидизации их ядер. Морфологические проявления кератолитического эффекта говорят о том, что подобные мазевые композиции могут оказаться полезными при лечении как ретенционного, так и пролиферационного гиперкератоза. Некоторые изменения структуры кожи контрольных животных в условиях длительного эксперимента (вакуолизация кератиноцитов, участки паракератоза) обусловлены, по-видимому, возрастным фактором. Некоторые из выявленных изменений могут быть расценены как реактивные (инфильтрация дермы) и слабовыраженные деструктивные (вакуолизация кератиноцитов, редкие нарущения целостности дермо-эпидермального соединения), свидетельствующие о напряжении функционирования структурных элементов кожи в условиях воздействия ксенобиотика. Результаты исследования кожи животных через 1 мес. после окончания воздействия ММ демонстрируют отсутствие выраженного персистирования кератолитического эффекта и пролонгирование феномена уменьшения толщины эпидермиса.

Выводы

Мочевина в составе мазей для накожного нанесения в условиях кратковременного (2 нед.) и длительных (1 и 6 мес.) экспериментов оказывает на кожу экспериментальных животных кератолитическое воздействие, морфологическими проявлениями которого являются разрыхление, разволокнение PC эпидермиса — как межфолликулярного, так и в устьях ВФ, и отслойка его от эпителиального пласта; вызывает уменьшение толщины клеточного эпидермиса.
Мочевина в составе мазей для накожного нанесения в условиях кратковременного (2 нед.) эксперимента вызывает снижение содержания ДНК-синтезирующих кератиноцитов.
Морфологические проявления кератолитической активности мочевины после отмены препаратов частично исчезают, в то время как уменьшение толщины клеточного эпидермиса отличается стойкостью.
Эффективность воздействия мочевины в составе мази на избыточное ороговение эпидермиса обусловливается не только ее прямым кератолитическим действием, но и уменьшением образования роговых пластов вследствие снижения пролиферативной активности кератиноцитов.

В. И. Ноздрин, Т. А. Белоусова, О. А. Лаврик, С. А. Жучков, Е. Г. Крутых, В. И. Альбанова

Литература

Заец Т. Л., Завьялов С. К. // Вестн. АМН СССР. — 1961. — №7. — С. 12—16.
Эвтаназия экспериментальных животных: Метод. рекомендации по выведению животных из эксперимента. — М., 1985.
Ademola J., Frazier C., Kim S. J. ct al. // Am. J. Clin/ Dermatol. — 2002. —Vol. 3, N3. — P. 217— 222.
Ashton H., Frenk E., Stevenson C. J. // Br. J. Dermatol. — 1971. — Vol. 84, N2. — P. 194—196.
Brawn W., Wohlrab W. // Dermatol. Mschr. — 1974. — Bd 160, N 11. — S. 923.
Hagemann L., Proksch E. // Acta Dermato-Venerol. (Stockh.). — 1996. —Vol. 76, N 5. — P. 353—356.
Loden M. // Arch. Dermatol. Res. — 1996. — Vol. 288, N 2. — P. 103—107.
Wohlrab W., Bohm W., Pankow B., Peker J. // Dermatol. Mschr. — 1994. — Bd 160, N 5. — S. 378—380.
Wohlrab W. // Acta Dermato-Venereol. (Stockh.). — 1984. — Vol. 64, N 3. — P. 233—238.
Wohlrab W. // Z. Hauthrankh. — 1990. — Bd 65, N 9. — S. 8003—805.